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慢病毒载体作为一种在基因和细胞治疗中应用广泛的关键工具，因其能够在分裂和非分裂细胞中稳定整合基因组，近年来受到了业界的广泛关注。在过去的几十年中，慢病毒载体的生产和纯化工艺经历了显著的变化，以迎合对更大量和纯度更高的需求，催生了新的材料与策略发展，以更为经济有效的方式提供慢病毒载体。本文对每个下游过程单元进行了更为详尽的分析、评价其局限性、优势以及可能带来的结果。
1. 引言
慢病毒作为逆转录病毒科的一种包膜病毒，因其在分裂和非分裂细胞中有效整合基因的能力，成为生物制药行业的重要工具。与γ-逆转录病毒载体相比，其基因整合模式具有更低的风险。这些特点扩展了慢病毒在功能基因组学、细胞工程研究、重组蛋白生产及临床基因治疗方面的应用。从2010年代起，基于慢病毒的基因治疗临床试验明显增加，特别是在2019年，这类试验占据了所有基因治疗试验的10%以上。这些临床应用主要包括利用慢病毒进行造血干细胞或T细胞的转导，以及基因传递到中枢神经系统和视网膜。且在2017年，美国食品药品监督管理局批准了两项CAR-T细胞疗法，用于治疗B细胞淋巴瘤和白血病，这进一步证明其在临床上的成功应用。为了支持这些临床试验的成功，推进慢病毒的纯化方法是必不可少的。无论是提升纯化的量，还是改进小规模使用所需的传统方法，这些都是更大规模应用的必要条件。
2. 传统LV纯化与浓缩方法
传统的LV纯化与浓缩法主要用于实验室小规模研究，其中离心技术是一种常见方法。通过蔗糖或碘克沙醇的超速离心可以在浓缩的同时进行一定程度的纯化。然而，这种方法在可扩展性和杂质控制方面可能存在不足。此外，实验表明，尽管超速离心能有效提高纯度，但也可能降低慢病毒颗粒的感染力。因此，越来越多的研究倾向于采用更具功能性的技术来改善传统技术的缺点。
3. 可扩展的LV下游处理方法
随着科研进展，近年来出现了使用色谱和膜技术的更为先进的下游处理方法。这些过程一般分为以下三个阶段：i) 收获和澄清；ii) 中间纯化，其中包括一个或数个浓缩和纯化步骤；iii) 抛光、配方和灭菌。当前，许多大规模的慢病毒载体制造过程仍主要依赖于贴壁细胞培养，尽管悬浮细胞培养已逐渐受到重视。为使下游过程更高效，氧化核酸的操作已逐渐成为必不可少的步骤，它能够在几个阶段有效地进行，增强了核酸的清除率。
4. 澄清与中间纯化
在澄清步骤中，LV是通过深层过滤或离心等方法来去除细胞或细胞碎片的。这一步的优化确保了上清液的最终质量。尽管如此，为了更好地适应市场需求，随着科技进步和需求量增加，将上游过程与DSP中早期的步骤合并，可能带来明显益处。对于中间纯化，阴离子交换色谱（AEX）和亲和色谱（AC）是主要的纯化手段。AEX技术结合经济有效性与可扩展性，为大量纯化提供了可靠选择。而亲和色谱则因其高选择性，有着提升纯度的潜力。
5. 技术进展与未来趋势
在技术发展方面，切向流过滤（TFF）已得到广泛应用，用于浓缩和透析病毒。此外，制造工艺的最新进展也在破解实现完全连续生物流程上的难题，为高纯度和生产力奠定了基础。慢病毒载体的纯化流程，尽管在提升回收率上仍需改进，但通过当前技术的发展，其无疑有能力在未来实现更广泛的临床应用。
综上所述，慢病毒载体在生物制药领域扮演着日益重要的角色。随着制备工艺的逐步完善和新生技术的引入，慢病毒载体未来在不同临床领域中的应用潜力将持续扩大。无疑，跨领域合作以及技术的不断进步将成为推动慢病毒载体发展的关键。
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